Uz NGS balstīta metode ar prettuberkulozes terapiju saistīto farmakogēnu analīzei: gēnu atlase un amplificēšanas soļa izstrāde.

Abstract

Ievads. Farmakoģenētiskajos pētījumos pārsvarā tiek apskatīts neliels skaits ģenētisko variantu, kuriem ir zināma saistība ar tuberkulozes (TB) pacientu vidū pastāvošajām atšķirīgajām atbildes reakcijām uz prettuberkulozes terapiju. Nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) metode ļauj vienlaikus analizēt vairākus interesējošos genoma reģionus, tādējādi veicinot ģenētisko variantu atklāšanu ar klīniski nozīmīgu ietekmi. Mērķis. Šī pētījuma mērķis bija atlasīt ar prettuberkulozes terapiju saistītus farmakogēnus un izstrādāt amplificēšanas soli mērķētās NGS darbplūsmai. Materiāli un metodes. Gēni ar apstiprinātu vai iespējamu saistību ar prettuberkulozes zāļu vielu farmakokinētiku vai blakusparādību attīstību tika atlasīti no publiski pieejamajām datubāzēm (PharmaADME.org, PharmGKB) un literatūras. Praimeri tika izveidoti, izmantojot Primer-BLAST rīku, kuru mērķis bija eksoni un blakus esošās intronu sekvences (≥100 bp), kā arī netranslētie reģioni (≥500 bp). Praimeru veiktspēja tika izvērtēta ar PCR, izmantojot cilvēka DNS paraugus (n=48), kas tika saņemti no Latvijas Valsts Iedzīvotāju Genoma Datu Bāzes. Iegūtie PCR produkti tika identificēti, izmantojot Sanger sekvencēšanas metodi. Rezultāti. Farmakoģenētiskajai analīzei tika atlasīti 11 interesējošie gēni (AADAC, CES2, SLCO1B1, SLCO1B3, ABCB1, XDH, NAT2, GSTM1, GSTT1, G6PD un PXR) un pilna garuma mitohondriālais genoms. Kopumā tika izveidoti 80 praimeru pāri, kuri amplificēja 1141–5854 bp garus fragmentus, un kopējais mērķa garums bija 268 kb. PCR amplifikācijas rezultātā tika iegūti specifiski produkti, kuri atbilda mērķa fragmentu garumam. Pirms NGS bibliotēkas sagatavošanas, praimeru pāriem, kuri amplifikācijas laikā ģenerē papildu fragmentus, jāveic amplikonu pirmapstrāde. Sanger sekvencēšanas rezultāti apstiprināja, ka amplifikācijas produkti atbilst mērķa gēniem, tādējādi pierādot izstrādātā protokola pareizību. Secinājumi. Piedāvātais protokols var sniegt spēcīgu pamatu uz NGS balstītai sekvencēšanas darbplūsmai, kuru var izmantot visaptverošai farmakoģenētiskai analīzei, kuras mērķis ir noskaidrot cilvēka ģenētisko faktoru nozīmi TB pacientu atbildes reakcijā uz prettubekulozes terapiju.

Introduction. Pharmacogenetic studies often target only limited numbers of genetic variants associated with interindividual variability in anti-tuberculosis (anti-TB) treatment response. The next-generation sequencing (NGS)-based approaches enable simultaneous analysis of multiple genomic regions of interest, thus facilitating the discovery of genetic variants with clinically relevant consequences. Objectives. This study aimed to select anti-TB treatment-associated genes of pharmacogenetic importance and develop targeted amplification step in the NGS-based workflow. Materials and methods. The genes with a confirmed or putative relationship with anti-TB drug pharmacokinetics or side-effect occurrence were derived from publicly available databases (PharmaADME.org, PharmGKB) and literature. Primers were designed using the Primer-BLAST tool to target exons including flanking intron sequences (≥100 bp) and untranslated regions with ≥500 bp sequence fragments. Primer performance was evaluated by PCR of human DNA samples (n=48) received from the Genome Database of the Latvian Population. Obtained PCR products were identified using Sanger sequencing method. Results. In total, 11 genes of interest (AADAC, CES2, SLCO1B1, SLCO1B3, ABCB1, XDH, NAT2, GSTM1, GSTT1, G6PD, and PXR) along with full-length mitochondrial genome were considered for the pharmacogenetic analysis. Overall, 80 primer pairs were designed to amplify 1141-5854 bp long fragments, and the total target size was 268 kb. PCR amplification resulted in specific products within the expected fragment length. For primer pairs generating additional fragments, amplicon pre-treatment step prior to NGS library preparation should be introduced. Nevertheless, Sanger sequencing results proved that amplification products correspond to target genes, therefore verifying the accuracy of the developed protocol. Conclusions. The proposed protocol can provide a strong basis for the NGS-based sequencing workflow used in a comprehensive pharmacogenetic analysis aiming to clarify the role of human genetic factors in anti-TB treatment response.