Trimetilamīna N-oksīds, ar aterosklerozi saistīts metabolīts, neietekmē no kaulu smadzenēm izolēto makrofāgu polarizāciju

Abstract

Mērķi: Zināms, ka zarnu mikrobiota atkarīgais metabolīts trimetilamīna N-oksīds (TMAO) ietekmē endotēlija iekaisumu un inducē iekaisuma citokīnu izdalīšanos in vitro un in vivo, veicinot aterosklerozes attīstību. Tādējādi šī pētījuma mērķis bija izpētīt, vai TMAO ietekmē makrofāgu polarizāciju pret iekaisuma (M1) un pretiekaisuma (M2) fenotipiem. Materiāli un metodes: Primārie kaulu smadzeņu atvasinātie makrofāgi (BMDM) tika izolēti no C57BL6 / J peles augšstilbiem. TMAO ietekme uz šūnu dzīvotspēju tika noteikta spektrofotometriski, izmantojot MTT testu. Lai pārbaudītu, vai TMAO ietekmē makrofāgu polarizāciju, BMDM vai nu inkubēja 48 stundas tikai ar TMAO, vai arī iepriekš inkubēja ar TMAO 24 stundas un turpināja nakti stimulēt ar LPS (10 ng / ml) un IFNγ (100 U / ml), lai diferencētos pēc M1 fenotipa vai ar IL-4 (10 ng / ml) pret M2 fenotipu. Virsmas marķieru (CD80 un CD86 M1; CD206 un CD301 M2) izpausme tika novērtēta, izmantojot plūsmas citometriju. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot programmatūru GraphPad Prism. Rezultāti: TMAO (līdz 1 mM) neietekmēja makrofāgu dzīvotspēju. Tādēļ šādiem eksperimentiem tika izvēlētas 100 µM un 1 mM koncentrācijas. Plūsmas citometrijas analīze parādīja, ka šūnu inkubācija ar TMAO neietekmē M1 un M2 virsmas marķieru ekspresiju nestimulētos BMDM. Reaģējot uz LPS / IFNγ stimulāciju, CD80 + CD86 + šūnu skaits palielinājās 4,5 reizes (29%), salīdzinot ar nestimulētajām šūnām (6,5%). TMAO atkarībā no devas palielināja CD80 + CD86 + šūnu populāciju līdz 36% (p <0,05). IL-4 stimulētos BMDM inkubācija ar TMAO neietekmēja CD206 + CD301 + šūnu procentuālo daudzumu. Secinājumi: Koncentrācijā līdz 1 mM TMAO nav toksisks BMDM. TMAO pats par sevi neizraisa iekaisuma procesus makrofāgos, tomēr, ja citi stimuli aktivizē iekaisumu, TMAO var veicināt makrofāgu polarizāciju pret iekaisumu veicinošu fenotipu. Atzinība: Latvijas Zinātnes padomes projekts “Trimetilamīna-N-oksīds kā saikne starp neveselīgu uzturu un kardiometaboliskajiem riskiem” Nr. 2018/1-0081.

Objectives: Intestinal microbiota-dependent metabolite trimethylamine N-oxide (TMAO) is known to impact endothelial inflammatory injury and induce the release of inflammatory cytokines in vitro and in vivo, contributing to the development of atherosclerosis. Thus, this study aimed to investigate whether TMAO affects macrophage polarization towards pro-inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) phenotypes. Materials and methods: Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were isolated from C57BL6/J mice femurs. The effect of TMAO on cell viability was determined spectrophotometrically using MTT assay. To test whether TMAO affects macrophage polarization, BMDMs were either incubated for 48h with TMAO only or preincubated with TMAO for 24h and further stimulated overnight with LPS (10 ng/ml) and IFNγ (100 U/ml) towards the differentiation to M1 phenotype or with IL-4 (10 ng/ml) towards the M2 phenotype. The expression of surface markers (CD80 and CD86 for M1; CD206 and CD301 for M2) was assessed using flow cytometry. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism software. Results: TMAO (up to 1 mM) did not affect macrophage viability. Therefore, 100 µM and 1 mM concentrations were chosen for the following experiments. Flow cytometry analysis revealed that incubation of cells with TMAO does not affect the expression of M1 and M2 surface markers in non-stimulated BMDMs. In response to LPS/IFNγ-stimulation, the number of CD80+CD86+ cells increased 4.5-fold (29%) compared to non-stimulated cells (6.5%). TMAO dose-dependently increased the population of CD80+CD86+ cells up to 36% (p<0.05). In IL-4-stimulated BMDMs, incubation with TMAO did not affect the percentage of CD206+CD301+ cells. Conclusions: In concentrations up to 1 mM, TMAO is not toxic to BMDMs. TMAO itself does not induce inflammatory processes in macrophages, however, if inflammation-mediating signalling pathways are activated by other stimuli, TMAO can promote macrophage polarization towards pro-inflammatory phenotype. Acknowledgement: Latvian Council of Science project “Trimethylamine-N-oxide as a link between unhealthy diet and cardiometabolic risks” No. Izp-2018/1-0081.