Ar fluorhinolonu rezistenci saistīto mutāciju identificēšana Mycobacterium tuberculosis gyrA un gyrB gēnos SIT1 un SIT42 spoligotipiem.

Abstract

Darba tēma: Ar fluorhinolonu rezistenci saistīto mutāciju identificēšana Mycobacterium tuberculosis gyrA un gyrB gēnos SIT1 un SIT42 spoligotipiem. Darba autors: Anna Liepiņa Darba vadītājs: MPharm. Darja Aļeiņikova Darba mērķis ir izstrādāt uz polimerāzes ķēdes reakcijas balstītu metodi pilnu gyrA un gyrB gēnu amplifikācijai un identificēt ar rezistenci saistītas mutācijas Latvijā sastopamajiem fluorhinolonu rezistento Mycobacterium tuberculosis genotipu paraugiem. Pētnieciskais darbs veidots no divām daļām. Teorētiskajā daļā apkopota un analizēta informācija par M. tuberculosis rezistences noteikšanas metodēm, molekulāro genotipešanu, īpašu uzmanību vēršot spoligotipēšanas metodei; par fluorhinoloniem, to darbības mehānismu un rezistences veidošanos, kā arī par gyrA un gyrB gēnu mutācijām, kurām eksperimentālajos pētījumos ir pierādīta saistība ar fluorhinolonu rezistenci. Praktiskajā daļā tika izveidota un optimizēta polimerāzes ķēdes reakcija pilnu gyrA un gyrB gēnu amplifikācijai, izmantojot M. tuberculosis laboratorijas celma (H37Rv) DNS paraugu kā standartu. No SIA Rīgas Austrumu klīniskās universitātes slimnīcas (RAKUS) Laboratorijas dienesta “Tuberkulozes un plaušu slimību centra” (TPSC) stacionāra laboratorijas arhīva tika saņemti M. tuberculosis kultūru DNS paraugi, viena daļa no kuriem bija fluorhinolonu rezistenta un otra daļa – fluorhinolonu jutīga. Visiem paraugiem tika noteikts spoligotips, unbalstoties uz fluorhinolonu rezistento paraugu spoligotipiem, tika izveidota kontroles grupa, kas iekļāva to pašu spoligotipu fluorhinolonu jutīgos paraugus. Izveidotai paraugu kopai tika veikta gyrA un gyrB gēnu amplifikācija, amplikonu sekvenēšana pēc Sangera metodes un identificētas ar fluorhinolonu rezistenci saistītas mutācijas.

Research topic: Identification of fluoroquinolone resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes for SIT1 and SIT42 spoligotype. Author: Anna Liepina Scientific superviser: MPharm. Darja Aleinikova The aim of this work is to develop a polymerase chain reaction-based method for the amplification of the whole gyrA and gyrB genes and to identify resistance-associated mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis genotypes in Latvia. The research work consists of two parts. The theoretical part summarizes and analyzes information on M. tuberculosis resistance assessing methods, molecular genotyping, with particular emphasis on the spoligotyping method; on fluoroquinolones, their mechanism of action and the development of fluouroquinolone resistance, as well as mutations in the gyrA and gyrB genes that have been shown to be associated with fluoroquinolone resistance in experimental studies. In the practical part, the polymerase chain reaction for the amplification of the whole gyrA and gyrB genes was developed and optimized using a DNA sample of M. tuberculosis laboratory strain (H37Rv) as a standard. DNA samples of M. tuberculosis cultures were received from the laboratory archive of Riga East University Hospital (RAKUS) Tuberculosis and Lung Diseases Centre (TPSC) one part of which was fluoroquinolone resistant and the other part - fluoroquinolone sensitive. All samples were spoligotyped and, based on the fluorolquinolone-resistant sample spoligotypes, a control group was established that included fluoroquinolone-sensitive samples of the same spoligotype. Amplification of the gyrA and gyrB genes, sequencing of amplicons by the Sanger method was performed, and mutations associated with fluoroquinolone resistance were identified.