Alfa-sinukleīna un vīrusveidīgo daļiņu konjugāta kā potenciāla vakcīnas kandidāta pret Parkinsona slimību iegūšana un biofizikāla raksturošana.

Abstract

Darba mērķis bija iegūt un attīrīt AP205-α-sinukleīnu konjugātu kā vakcīnas kandidātu pret Parkinsona slimību un raksturot to ar biofizikālajām analīzes metodēm. Darbā sekmīgi veica AP205 un α-sinukleīna konjugāta producēšanu E. coli šūnās, kā arī tā attīrīšanu ar gelfiltrācijas un jonapmaiņas hromatogrāfiju. Izstrādāta metode 13C un 15N iezīmēta AP205-α-sinukleīna iegūšanai E. coli šūnās minimālajā M9 barotnē. AP205-α-sinukleīna konjugāts iegūts pietiekamā daudzumā ar augstu tīrības pakāpi gan priekš biofizikālajām analīzes metodēm, gan priekš KMR eksperimentiem. Ar biofizikālajām metodēm (FTIR, AFM, TEM, ThT fluorescenci) noteikta morfoloģiskā struktūra. ELISA tests pierādīja AP205-α-sinukleīna konjugāta saistīšanos ar konformacionāli specifiskajām α-sinukleīna antivielām. Ar 2D, 3D un 5D KMR eksperimentiem noteica konjugāta struktūru atomārā līmenī, un pēc iegūtajām vērtībām aprēķināja, ka α-sinukleīna daļa paliek nestrukturēta, kad tā ir piesaistīta pie AP205 vīrusveidīgās daļiņas.

The aim of the work was to obtain AP205-α-synuclein conjugate as a vaccine candidate against Parkinson's disease and to characterize it using biophysical analysis methods. The production of the AP205-α-synuclein conjugate in E. coli cells and its purification by gel filtration and ion exchange chromatography were successfully carried out in this work. A method for the expression of 13C and 15N-labeled AP205-α-synuclein in E. coli cells in minimal M9 medium was developed. The AP205-α-synuclein conjugate was obtained in sufficient quantity and purity for both biophysical analysis methods and NMR experiments. The morphological structure was determined using biophysical methods like FTIR, AFM, TEM, ThT fluorescence, and the binding of the conjugate to conformationally specific α-synuclein antibodies was verified using ELISA assay. The structure of the conjugate at the atomic level was determined with 2D, 3D and 5D NMR experiments. The obtained values were used for calculation of secondary structure, which showed that the α-synuclein part of conjugate is structurally disordered.