EBV infekcijas pētījums Latvijas kohortā neārstētiem pacientiem ar divām dažādām hroniskas limfoleikozes formām.

Abstract

Pētījums tika veikts, lai izpētītu hipotēzi, ka Epšteina-Barra vīrusa (EBV) infekcija varētu būt saistīta ar agresīvu augsta riska hroniskas limfoleikozes (HLL) formu, ar nemutējušiem imūnglobulīna smagās ķēdes variablo reģionu gēniem (IGHV), tādējādi veicinot HLL slimības agresivitāti un smagumu. Šīs hipotēzes ietvaros pētījuma mērķis bija analizēt EBV DNS kopiju klātbūtni un daudzumu perifēro asiņu mononukleārajās šūnās (PAMŠ) HLL pacientiem un saistīt EBV DNS slodzes ar divām HLL formām: kūtru (indolent), zema riska slimību un agresīvu augsta riska HLL ar nemutējušu IGHV (umIGHV). Asins paraugi tika paņemti Rīgas Austrumu universitātes slimnīcas (RAKUS) Ķīmijterapijas un hematoloģijas klīnikā un pēc primārās diagnozes ar HLL slimību nogādāti pētījuma izmeklējumiem uz RSU Mikrobioloģijas un virusoloģijas institūtu, kur tika izdalītas PAMŠ. EBV DNS slodzes (kopiju skaits) tika noteiktas PAMŠ DNS paraugos, izmantojot reālā laika kvantitatīvās polimerāzes ķēdes reakcijas (PĶR) metodi. IGHV mutācijas statuss HLL pacientiem tika analizēts, izmantojot multiplekso PĶR metodi ar sekojošu PĶR produktu sekvencēšanu. Pacientu klīnisko izmeklējumu dati, saskaņā ar ētikas komisijas atļauju, tika apkopoti iepriekšējā pētījuma projekta ietvaros (Nr. lzp-2018/1-0156) un anonimizēti. Šajā pētījumā tika iekļauti 62 neārstēti HLL pacienti, tajā skaitā, izmantojot Rai klīniskās stadijas noteikšanas sistēmu, 22 pacientiem tika diagnosticēta HLL slimības 0.stadija, 6 pacientiem – I. stadija, 26 pacientiem – II. stadija un 8 pacientiem – III-IV. stadija. Limfocītu skaits HLL pacientu asinīs statistiski nozīmīgi atšķīrās (p<0,05) starp 0. un II. stadijām (p=0,004) un starp 0. un III-IV. stadijām (p=0,002). Pētījuma rezultāti parādīja, ka līdz ar HLL slimības klīniskās stadijas palielināšanos pakāpeniski palielinājās arī pacientu skaits ar umIGHV (no 40,9% 0. stadijā līdz 87,5% III-IV stadijā), apstiprinot nemutējuša umIGHV statusa saistību ar augsta riska HLL slimību. EBV DNS (> 5 kopijas uz 105 PAMŠ) tika atrasta 24 pacientiem, - 38,7% no visiem pētījumā iesaistītajiem pacientiem. Vislielākais EBV pozitīvo pacientu īpatsvars tika konstatēts HLL pacientu grupā ar III-IV. klīnisko stadiju: 50,0% pacientu bija EBV pozitīvi. Jāatzīmē, ka umIGHV dominēja EBV pozitīvajā grupā - 58,3% EBV pozitīvo pacientu bija umIGHV. Neskatoties uz to, ka atšķirības starp klīniskajām stadijām nebija statistiski nozīmīgas, tendence ir skaidri redzama: pirmkārt, vislielākā EBV pozitīvo pacientu proporcija (50,0%) tika konstatēta vēlīnās klīniskās stadijās un, otrkārt, bija vairāk EBV pozitīvo pacientu (58,3%) ar umIGHV, kas ir negatīvais HLL prognostiskais rādītājs. Ņemot vērā atrasto tendenci, varētu secināt, ka EBV var būt saistīts ar HLL slimības aktivitāti un agresivitāti un ka EBV varētu būt viens no faktoriem, kas ietekmē HLL progresēšanu. Tomēr, lai pārbaudītu atklāto tendenci un šī pētījuma sākotnējos secinājumus, ir nepieciešama lielākas HLL pacientu grupas izmeklēšana.

The study was conducted to investigate the hypothesis that the Epstein-Barr virus (EBV) infection might be linked to the aggressive high-risk form of chronic lymphocytic leukemia (CLL) with the unmutated immunoglobulin heavy chain variable region genes (IGHV), thus contributing to the aggressiveness and severity of the CLL disease. In the frame of this hypothesis, the aim of the study was to analyze the presence and the quantity of the EBV DNA copy number in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of CLL patients and to associate the EBV DNA loads with two CLL forms: an indolent low-risk disease and the aggressive high-risk CLL with the unmutated IGHV (umIGHV). The blood samples were collected in the Clinic of Chemotherapy and Hematology at Riga East University Hospital (REUH) and, after the primary diagnosis with the CLL disease, were transported for research examinations to the Institute of Microbiology and Virology at RSU, where PBMCs were isolated. The EBV DNA loads (copy numbers) were determined in PBMC DNA samples using a real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) method. The mutation status of IGHV in CLL patients was analyzed applying the multiplex PCR method with the following sequencing of the PCR-products. This study included 62 untreated CLL patients, among them, utilizing the Rai clinical staging system, 22 patients were diagnosed with the CLL disease stage 0, 6 patients – with the stage I, 26 patients – with the stage II, and 8 patients – with the stages III-IV. The number of lymphocytes in blood of CLL patients differed statistically significantly (p<0,05) between the stages 0 and II (p=0,004) and 0 and III-IV (p=0,002). The results of the study research demonstrated that with the increase of the CLL disease clinical stage, the number of patients with umIGHV was also gradually risen (from 40,9% in the stage 0 till 87,5% in the stages III-IV), confirming the association of the IGHV unmutated status with the high risk CLL disease. The EBV DNA (>5 copies per 105 of PBMCs) was detected in 24 patients, - in 38,7% of the all patients in the study. The highest proportion of the EBV-positive patients was found in the group of patients with the CLL clinical stages III-IV: 50,0% of patients were EBV-positive. Noteworthy, umIGHV prevailed in the EBV-positive group, - 58,3% of the EBV-positive patients had umIGHV. Although, the differences between the clinical stages were not statistically significant, the tendency is clearly seen: first, the highest proportion of the EBV-positive patients (50,0%) was found in the late clinical stages and second, there were more EBV-positive patients (58,3%) with umIGHV, the negative prognostic indicator in CLL. Considering the revealed tendency, it might be concluded that EBV can be linked to the activity and aggressiveness of the CLL disease, and that EBV could be one of the factors influencing the progression of CLL.